Lịch sử truyền giáo tại Việt Nam ghi nhận, vào năm 1555, một giáo sĩ dòng Đa Minh là Gaspar de la Cruz đã đặt chân lên đất Hà Tiên, bấy giờ vẫn còn thuộc vương quốc Khmer. Tuy nhiên đây là một chặng dừng ngắn ngủi của ông trên đường từ Malacca đến Quảng Châu.

Năm 1659, Tòa Thánh lập 2 giáo phận đầu tiên tại Việt Nam. Trong gần 200 năm, địa phận giáo phận Cần Thơ ngày nay thuộc Giáo phận Đàng Trong thời bấy giờ. Năm 1844, Giáo phận Đàng Trong được chia thành hai giáo phận Tây Đàng Trong và Đông Đàng Trong. Chỉ 6 năm sau đó, năm 1850, Giáo phận Tây Đàng Trong được chia thành hai: Giáo phận Tây Đàng Trong (Nam Kỳ Lục tỉnh) và Giáo phận Cao Miên (còn gồm cả Vương quốc Champasak). Năm 1868, hai tỉnh Hà Tiên và Châu Đốc (tên cũ là An Giang) của Nam Kỳ lục tỉnh được sáp nhập vào Giáo phận Cao Miên. Địa giới giáo phận Cần Thơ ngày nay thuộc Giáo phận Cao Miên (năm 1924 đổi thành Nam Vang) khi đó.

Ngày 20 tháng 9 năm 1955, Giáo hoàng Piô XII ra Sắc chỉ Quod Christus tách phần đất của Việt Nam thuộc Giáo phận Nam Vang gồm 10 tỉnh lúc đó: An Giang, Kiên Giang, Phong Dinh, Chương Thiện, Ba Xuyên, Châu Đốc, Bạc Liêu, Hà Tiên, Sa Ðéc và An Xuyên để thành lập một giáo phận mới lấy tên gọi là Giáo phận Cần Thơ, đặt tân Giám mục Phaolô Nguyễn Văn Bình làm Giám quản Tông tòa. Khi thành lập, giáo phận Cần Thơ có 148.610 giáo dân, 110 linh mục, 300 nữ tu dòng Chúa Quan Phòng, 10 nữ tu dòng Con Ðức Mẹ, 3 nữ tu tu hội Bác Ái Vinh Sơn, 11 sư huynh dòng La San và 9 đại chủng sinh. Đến ngày 24 tháng 11 năm 1960, Tòa Thánh thiết lập Hàng Giáo phẩm Việt Nam, nâng giáo phận hiệu tòa Cần Thơ lên hàng giáo phận chính tòa, thuộc Giáo tỉnh Saigòn.

Ba ngày sau, ngày 27 tháng 11 năm 1960, Tòa Thánh tách 4 tỉnh của giáo phận Cần Thơ là An Giang, Kiên Giang, Châu Ðốc và Hà Tiên để lập Giáo phận Long Xuyên, một phần tỉnh An Giang (Cù Lao Tây và Hồng Ngự) nhập vào Giáo phận Mỹ Tho, phần khác của tỉnh là Sa Ðéc nhập vào Giáo phận Vĩnh Long. Sau khi phân chia, giáo phận Cần Thơ chỉ còn diện tích hơn 13.000 km2 với 67 linh mục và 56.200 giáo dân trên tổng số dân là 1,410,000 người.

Ngày nay, Giáo phận Cần Thơ nằm về phía hữu ngạn sông Hậu Giang, Ðông Bắc giáp Giáo phận Vĩnh Long (tả ngạn sông Hậu); Tây Bắc giáp Giáo phận Long Xuyên; Tây giáp vịnh Thái Lan, Ðông giáp biển Ðông. Tổng diện tích 13.258 km2, tương ứng địa bàn 5 tỉnh thành Thành phố Cần Thơ (trừ huyện Thốt Nốt thuộc giáo phận Long Xuyên), Hậu Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau, theo Báo cáo Mục vụ 2014, có 187.846 giáo dân (2.691 người Khmer và 475 người Hoa), 207 linh mục, 344 tu sĩ đang phục vụ trên 143 họ đạo (116 có LM, 27 không có LM). Toàn giáo phận gồm 7 giáo hạt: Cần Thơ, Ðại Hải, Trà Lồng, Vị Thanh, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau. Với 94 giáo xứ có linh mục và 35 họ đạo không có linh mục. Địa bàn giáo phận nằm gọn trong vùng đồng bằng sông Cửu Long với hệ thống sông ngòi chằng chịt như sông Hậu Giang, Cái Tư, kênh Quảng Lộ, kênh Sáng Sà No, kênh Phụng Hiệp... Thành phần dân cư đa số là người Kinh, ngoài ra còn có người Khmer (khoảng 50.000) và người Hoa (nhất là vùng Sóc Trăng và Bạc Liêu).